Takker for gode svar.Det gleder meg å høre at folk begynder med frysing. Det gir både bedre bryggeøkonomi og stor glede! Kom gjerne med ytterligere spørsmål.
Et par kommentarer:
Jeg mener fortsatt at det er uhensiktsmessig med 15 mL-rør, da disse tar lengre tid å tine. Opptiningsfasen er kanskje den mest kritiske delen av prosessen, og dannelse av intracellulære iskrystaller og/eller frie oksygenforbindelser er veldig skadelig for gjæren. Jeg vil anbefale å bruke en størrelse på 2.0 mL. Men det er ikke feil det du gjør, og det vil fungere.
121˚C i 15 minutter i trykkoker er industristandard sterilisering - veldig bra. Husk å ikke skru til lokkene under denne prosessen. Bruk eventuelt autoklavtape, eller annet festemiddel for å holde lokkene på plass.
Har du en fryser uten "defrost"-syklus? Jeg er ikke sikker på om kjølelementene vil beskytte godt nok under disse syklene. Anbefaler at rørene står i en isopropanolløsning eller lignende i fryseren.
Å inokulere en stor starter med en liten mengde gjær er i utgangspunktet ikke problematisk hvis du har vært nøye med hygienen. Men det tar mye lengre tid, og det blir mye vanskeligere for deg å finne ut om gjæren din har overlevd frysingen. Du får dessuten neppe 30 milliarder levende celler opp fra fryseren - mengden vil reduseres.
Jeg ville ikke gått rett på 5 liter hvis jeg var deg. Normalt begynner jeg med 150 mL og 2.0 milliarder celler. Selv der, kan det ta litt tid før man ser noen tydelig aktivitet.
Å blåse oksygen ned i kolben ved inokulering tror jeg er helt unødvendig, men det er sikkert et fint rituale.
Det virker som om du bruker unødvendig mye gjærnæring. Jeg pleier å tilsette 0.32 g. til 3.5 liter starter. Det er veldig langt fra en halv teskje.
Når jeg fryser gjær, bruker jeg sterile engangspipetter i plast (hvis jeg en sjelden gang trenger veldig nøyaktige mål, bruker jeg en mikropipette, men da må det være noe veldig kritisk som skal skje) til å hente ut gjær fra starteren før jeg brygger (henter aldri gjær fra ferdig brygg). Det er veldig viktig at gjæren er i dvalefase (G0) når den fryses, så den kan gjerne stå i kjøleskabet en stund. Jeg pleier å blande opp 50 mL av en stamløsing med glycerol i 30% konsentrasjon med destillert vann, som jeg har stående, og tilsetter til gjær som skal fryses. 50 mL holder veldig lenge når man bruker 2.0 mL-rør.
Dette lar jeg sedimentere i rørene i et døgn før jeg pipetterer av overskydende vædske, tilsetter glycerol, vender rørene 10-12 ganger, og derefter lar dem stå i kjøleskab en times tid for å sørge for å få en jevn blanding av gjærceller, vann og glycerol. Derefter vender jeg rørene 2-3 ganger til jeg har en homogen blanding, og fryser dem. Jeg har ikke noen sofistikert løsning for langsom nedfrysing.
Når gjæren skal brukes, henter jeg ett rør, tiner det i hånden i løbet av ca. 30 sekunder, og inokulerer direkte i 150 mL DME-løsning.
Et viktig råd: Vær raus med engangspipetter. Overføring og glyceroltilsetning medfører kontaminasjonsfare. Særlig om du fryser flere ulike gjærstammer samtidig, risikerer du krysskontaminasjon om du ikke er veldig nøyaktig. Å tilsette gjæren i rør med glycerolløsning eliminerer noe av denne faren, men ikke risikoen for kontaminasjon av andre mikroorganismer. Jobb i en ren - helst aseptisk sone. Man trenger ikke jobbe helt sterilt, men må være grundig.
Skjønner at jeg bør bruke 2 ml, og det skal absolutt prøves når desse er anskaffet.
Det blir nok da som du anbefaler, å steppe starterene gradvis fra de nedfryste rørene.
Har lekt med tanken om å bygge meg en egnet renroms boks (flow-hood) med hepafilter H13 eller H14. Dette vil vel redusere faren for kontaminasjon betraktelig vil jeg tro.
Skal uansett teste nedfrysing i de 15 ml rørene jeg har, ettersom det er dette jeg har nå. Blir uansett en læringsprosess dette.
Det er jo bare supert å ha så flinke fagfolk å spørre her på forumet .
Takker