Hemocytometer, tellekammer
- Trådstarter JohnH44
- Startdato
Jeg kan gjerne prøve å hjelpe deg, men vil gjerne ha litt mer informasjon.
Hva slags hemocytometer bruker du?
Hvilken tykkelse bruker du på dekkglasset?
Oppstår problemet både når du farver cellene og uten farving?
Hva slags mikroskop bruker du?
Opptrer dette ved alle forstørrelser, eller bare på high power?
Er det problematisk også hvis du fokuserer på et tellekammer uten at du har gjærceller der?
Kan du beskrive prosessen din, og så nøyaktig som mulig når og hvordan problemet manifesterer seg?
Jeg har travle dager, men skal finne tid til å følge opp dette. Jeg kan ikke nødvendigvis love raske svar, dessverre.
Hva slags hemocytometer bruker du?
Hvilken tykkelse bruker du på dekkglasset?
Oppstår problemet både når du farver cellene og uten farving?
Hva slags mikroskop bruker du?
Opptrer dette ved alle forstørrelser, eller bare på high power?
Er det problematisk også hvis du fokuserer på et tellekammer uten at du har gjærceller der?
Kan du beskrive prosessen din, og så nøyaktig som mulig når og hvordan problemet manifesterer seg?
Jeg har travle dager, men skal finne tid til å følge opp dette. Jeg kan ikke nødvendigvis love raske svar, dessverre.
Jeg har et hemocytometer som vist på bildet. Den er kjøpt fra Amazon og var ikke det billigste. Tykkelse på dekkglasset er 0,4 mm. Til farging har jeg Methylene Blue som avbildet. Det har ikke lykkes meg å finne frem til gunstig dosering, så jeg har ikke brukt den. Mikroskopet er Omax Model MD82ES10. Jeg bruker 100x og 400x.
Det var dagens situasjon. Jeg forbereder noen endringer som blir spennende.
Strekene på hemacytometeret synes jeg er tynne. Jeg ser dem med åpen kammer, åpen kammer med dekkglass og dårlig når jeg har prøve i kammeret. Jeg ser i denne fra Dåstøl (https://daastoel.com/2016/12/09/mikroskop/) at han har tykkere streker. Jeg har et nytt Hemacytometer i posten fra ebay.
Jeg skal prøve Trypan Blå 0.4% (https://brewshop.no/produkt/utstyr/maleutstyr/trypan-bla-04-20ml). Jeg ser på YouTube at den blandes 50/50 med prøven.
Til dosering av prøve og blåfarge har jeg kjøpt noen 0,5 mL sprøyter med tynn kanyle på apoteket. Det er greit å måle ut doser på 50 µL. Den tynne kanylen gjør at jeg kan ha velkontrollert størrelse på dråpen når jeg skal "mate" hemacytometeret. Jeg ser ikke bort fra at jeg har fått i for stor dose tidligere.
Jeg ser frem til dine kommentarer.
Det var dagens situasjon. Jeg forbereder noen endringer som blir spennende.
Strekene på hemacytometeret synes jeg er tynne. Jeg ser dem med åpen kammer, åpen kammer med dekkglass og dårlig når jeg har prøve i kammeret. Jeg ser i denne fra Dåstøl (https://daastoel.com/2016/12/09/mikroskop/) at han har tykkere streker. Jeg har et nytt Hemacytometer i posten fra ebay.
Jeg skal prøve Trypan Blå 0.4% (https://brewshop.no/produkt/utstyr/maleutstyr/trypan-bla-04-20ml). Jeg ser på YouTube at den blandes 50/50 med prøven.
Til dosering av prøve og blåfarge har jeg kjøpt noen 0,5 mL sprøyter med tynn kanyle på apoteket. Det er greit å måle ut doser på 50 µL. Den tynne kanylen gjør at jeg kan ha velkontrollert størrelse på dråpen når jeg skal "mate" hemacytometeret. Jeg ser ikke bort fra at jeg har fått i for stor dose tidligere.
Jeg ser frem til dine kommentarer.
Vedlegg
Takk for spesifikasjoner.
Jeg ser at mikroskopet ditt absolutt er kapabelt til oppgaven. Objektivene dine er helt greie, men vil ved høye forstørrelser kunne gi problemer med å få et jevnt fokus over hele synsfeltet. Dette har neppe større betydning for ditt formål.
Minuset med det mikroskopet du har, er at det ser ut til at du ikke har en fokuserbar feltblender under kondenseren, men det behøver ikke ha noen større betydning.
Jeg regner med at okularene dine er 10X-okularer?
Hemocytometret ditt burde være mer enn godt nok. Marienfeld leverer hemocytometre med høy kvalitet, og problemet burde ikke ligge her. Dekkglassene har korrekt tykkelse.
Metylenblått gir ikke veldig gode resultater, så overgang til trypanblått vil gi deg en mye enklere hverdag. Jeg skal komme tilbake til dette med konsentrasjon.
Min antagelse om hvor problemet ligger, er følgende:
-Lys- og kontrastinnstillinger på mikroskopet
-For høy forstørrelse for tidlig
-Fyllingsgraden i tellekammeret
-Celletettheten i prøven
En generisk arbeidsflyt er som følger:
1) Etablér Köhler-illuminasjon - dette er litt på siden med ditt mikroskop fordi du ikke har en feltblender under kondenseren, men innebærer at du skal ha et jevnt, lyst område over hele synsfeltet, uten noen variasjoner i lysstyrke eller mørke områder i randsonene.
2) Legg hemocytometret på objektbordet - med dekkplate, og bring det i fokus på laveste forstørrelse (40x).
3) Juster kontrast og lysstyrke slik at du ser strekene i tellekammeret tydelig. Du kan både justere kondenseren opp og ned, og justere irisblenderen (spaken foran på kondenseren). Kondenseren skal sannsynligvis være relativt høyt oppe. Irisblenderen kan du eksperimentere med. Hvis det er vanskelig å få god fokus her, har du sannsynligvis for høy lysstyrke (du trenger mer lys jo høyere forstørrelse du bruker)
4) Utfør nødvendig fortynning og eventuell farving. Notér fortynningsfaktoren din. Fyll tellekammeret.
5) Hvis cellene ikke er i godt fokus, forsøk å justere mikrometerskruen til du ser dem tydelig og velavgrenset. Justér kontrast etter behov (irisblender og kondenser). Hvis du mistet rutenettet fra fokus, kan kontrastinnstillinger ofte "hente opp" dette igjen. Hvis du ikke klarer å fokusere på begge deler, gå til feilsøking. Jeg kommer tilbake til dette. Hvis du bare har fyldt det ene tellekammeret, kan du bruke det andre som fokusreferanse. De har samme fokuspunkt.
6) Identifisér hva du skal undersøke, og sentrér det i synsfeltet. (Sentrér sentralkvadratet).
7) Bytt til 10x-objektivet (100x forstørrelse). Til celletelling trenger du svært sjelden høyere forstørrelse enn dette. Finjustér fokus og kontrast om nødvendig. Det kan være nødvendig å skru lysstyrken litt opp, men det er ikke alltid nødvendig.
8) Evaluér om fortynningen din er tilstrekkelig til å telle. Det skal være 25-75 celler i hvert av de små kvadratene i sentralkammeret. Cellene skal ligge i ro, og det skal ikke være luftbobler.
9) Bytt til 40x-objektivet (400x). Juster fokus, kontrast og lysstyrke etter behov.
10) Tell etter vanlig prosedyre (4+1 i sentralkammeret) og gjør kalkulasjoner forendelig resultat. Bruk et mentometer, eller en app (tallycounter). Det finnes dedikerte apper for celletelling, der du kan differensiere mellom døde og levende celler, og hvor appen kan gjøre en del utregninger for deg. Se "hemocytometer sidekick" eller "Hemocytapp" - begge tilgjengelige både for iOS og Android.
Hvis du fortsatt opplever problemer:
Hvordan fyller du hemocytometret?
Å bruke en tynn kanyle virker litt vel pedantisk. Det er ikke feil, men en pasteurpipette i glass eller plast gjør jobben like godt. Som oftest er det helt nødvendig å fortynne prøven. Prosedyren er som følger:
1) Legg dekkglasset på hemocytometret.
2) Fortynn etter behov. Rist cellesuspensjonen, så cellene er jevnt fordelt i væsken, og trekk opp den fortynnede cellesuspensjonen i pipetten
3) Legg spissen av pipetten inntil kanten av dekkglasset (hvis du skaffer et hemocytometer med fyllingsspalte, bruker du denne)
4) Trykk ut en ørliten mengde av suspensjonen, og la kapillærkrefter trekke væsken inn under dekkplaten. Da får du en jevn fordeling hele veien. Dette må øves på. Du skal ikke måle volumet.
5) Dersom væske flyter ut av tellekamrene, må du rense hemocytometeret og begynne på nytt. Da er det overfylt, og du får problemer med fokus, og cellene vil ligge i flere lag, eventuelt flyte omkring.
6) Dersom du ser luftbobler, er hemocytometeret underfylt. Da blir resultatene gale. Rens, og begynn på nytt.
Dersom du har mer enn 75 celler i hvert av de små kamrene i sentralkvadratet, blir tellingen vanskelig, og det kan bli vanskelig å fokusere. I så fall er ikke fortynningen din tilstrekkelig. Fortynning bør gjøres med NaCl 0.9%, men du kan bruke destillert vann.
Dersom du har mindre enn 25 celler i disse, blir resultatet upålitelig.
Ved eksklusjonsfarving, kan for høy farvekonsentrasjon gjøre det vanskelig å fokusere, og du må jobbe mye mer med lysstyrke og kontrast. For trypanblått, bør konsentrasjonen under mikroskopet være mellom 0.01 og 0.1%. Jeg anbefaler å tilvirke en stamløsning på 0.2%, og fortynne til riktig konsentrasjon når du forbereder prøven. Hvis du tilvirker løsning fra pulver, bruk sterilt, destillert vann, og filtrér med et 0.45 eller 0.22 μm.
Med ditt mikroskop, kan det være at farvekonsentrasjonen skal være heller i den høyere enden av skalaen enn den lavere. Eksperimenter deg frem til hva som fungerer.
Husk at trypanblått er cytotoksisk (giftig for cellene), og at du må telle innen 5 - 10 minutter. Ellers vil cellene begynne å dø, og du får mye lavere viabilitet enn cellekulturen din har i virkeligheten.
Husk å rense hemocytometer og dekkplate med minimum 70% sprit og linsepapir etter bruk (dekkplater kan kasseres, men de kan fint gjenbrukes, så sparer man litt penger).
Dersom du fortsatt har problemer med å fokusere på rutenettet under telling, vil jeg anbefale å skaffe et hemocytometer med et "brightline grid." Her er tellekamrene dekket med en rhodiumfilm, som gjør at strekene fremstår som lyse. Det er ofte lettere å se mønsteret med et slikt.
Dette er en kort oppsummering og feilsøking. Hvis du fortsatt har problemer eller spørsmål, skal jeg gjerne utdype. Jeg regner med at du er fortrolig med de kalkulasjonene du trenger. Det er jo nokså enkel matematikk.
Jeg ser at mikroskopet ditt absolutt er kapabelt til oppgaven. Objektivene dine er helt greie, men vil ved høye forstørrelser kunne gi problemer med å få et jevnt fokus over hele synsfeltet. Dette har neppe større betydning for ditt formål.
Minuset med det mikroskopet du har, er at det ser ut til at du ikke har en fokuserbar feltblender under kondenseren, men det behøver ikke ha noen større betydning.
Jeg regner med at okularene dine er 10X-okularer?
Hemocytometret ditt burde være mer enn godt nok. Marienfeld leverer hemocytometre med høy kvalitet, og problemet burde ikke ligge her. Dekkglassene har korrekt tykkelse.
Metylenblått gir ikke veldig gode resultater, så overgang til trypanblått vil gi deg en mye enklere hverdag. Jeg skal komme tilbake til dette med konsentrasjon.
Min antagelse om hvor problemet ligger, er følgende:
-Lys- og kontrastinnstillinger på mikroskopet
-For høy forstørrelse for tidlig
-Fyllingsgraden i tellekammeret
-Celletettheten i prøven
En generisk arbeidsflyt er som følger:
1) Etablér Köhler-illuminasjon - dette er litt på siden med ditt mikroskop fordi du ikke har en feltblender under kondenseren, men innebærer at du skal ha et jevnt, lyst område over hele synsfeltet, uten noen variasjoner i lysstyrke eller mørke områder i randsonene.
2) Legg hemocytometret på objektbordet - med dekkplate, og bring det i fokus på laveste forstørrelse (40x).
3) Juster kontrast og lysstyrke slik at du ser strekene i tellekammeret tydelig. Du kan både justere kondenseren opp og ned, og justere irisblenderen (spaken foran på kondenseren). Kondenseren skal sannsynligvis være relativt høyt oppe. Irisblenderen kan du eksperimentere med. Hvis det er vanskelig å få god fokus her, har du sannsynligvis for høy lysstyrke (du trenger mer lys jo høyere forstørrelse du bruker)
4) Utfør nødvendig fortynning og eventuell farving. Notér fortynningsfaktoren din. Fyll tellekammeret.
5) Hvis cellene ikke er i godt fokus, forsøk å justere mikrometerskruen til du ser dem tydelig og velavgrenset. Justér kontrast etter behov (irisblender og kondenser). Hvis du mistet rutenettet fra fokus, kan kontrastinnstillinger ofte "hente opp" dette igjen. Hvis du ikke klarer å fokusere på begge deler, gå til feilsøking. Jeg kommer tilbake til dette. Hvis du bare har fyldt det ene tellekammeret, kan du bruke det andre som fokusreferanse. De har samme fokuspunkt.
6) Identifisér hva du skal undersøke, og sentrér det i synsfeltet. (Sentrér sentralkvadratet).
7) Bytt til 10x-objektivet (100x forstørrelse). Til celletelling trenger du svært sjelden høyere forstørrelse enn dette. Finjustér fokus og kontrast om nødvendig. Det kan være nødvendig å skru lysstyrken litt opp, men det er ikke alltid nødvendig.
8) Evaluér om fortynningen din er tilstrekkelig til å telle. Det skal være 25-75 celler i hvert av de små kvadratene i sentralkammeret. Cellene skal ligge i ro, og det skal ikke være luftbobler.
9) Bytt til 40x-objektivet (400x). Juster fokus, kontrast og lysstyrke etter behov.
10) Tell etter vanlig prosedyre (4+1 i sentralkammeret) og gjør kalkulasjoner forendelig resultat. Bruk et mentometer, eller en app (tallycounter). Det finnes dedikerte apper for celletelling, der du kan differensiere mellom døde og levende celler, og hvor appen kan gjøre en del utregninger for deg. Se "hemocytometer sidekick" eller "Hemocytapp" - begge tilgjengelige både for iOS og Android.
Hvis du fortsatt opplever problemer:
Hvordan fyller du hemocytometret?
Å bruke en tynn kanyle virker litt vel pedantisk. Det er ikke feil, men en pasteurpipette i glass eller plast gjør jobben like godt. Som oftest er det helt nødvendig å fortynne prøven. Prosedyren er som følger:
1) Legg dekkglasset på hemocytometret.
2) Fortynn etter behov. Rist cellesuspensjonen, så cellene er jevnt fordelt i væsken, og trekk opp den fortynnede cellesuspensjonen i pipetten
3) Legg spissen av pipetten inntil kanten av dekkglasset (hvis du skaffer et hemocytometer med fyllingsspalte, bruker du denne)
4) Trykk ut en ørliten mengde av suspensjonen, og la kapillærkrefter trekke væsken inn under dekkplaten. Da får du en jevn fordeling hele veien. Dette må øves på. Du skal ikke måle volumet.
5) Dersom væske flyter ut av tellekamrene, må du rense hemocytometeret og begynne på nytt. Da er det overfylt, og du får problemer med fokus, og cellene vil ligge i flere lag, eventuelt flyte omkring.
6) Dersom du ser luftbobler, er hemocytometeret underfylt. Da blir resultatene gale. Rens, og begynn på nytt.
Dersom du har mer enn 75 celler i hvert av de små kamrene i sentralkvadratet, blir tellingen vanskelig, og det kan bli vanskelig å fokusere. I så fall er ikke fortynningen din tilstrekkelig. Fortynning bør gjøres med NaCl 0.9%, men du kan bruke destillert vann.
Dersom du har mindre enn 25 celler i disse, blir resultatet upålitelig.
Ved eksklusjonsfarving, kan for høy farvekonsentrasjon gjøre det vanskelig å fokusere, og du må jobbe mye mer med lysstyrke og kontrast. For trypanblått, bør konsentrasjonen under mikroskopet være mellom 0.01 og 0.1%. Jeg anbefaler å tilvirke en stamløsning på 0.2%, og fortynne til riktig konsentrasjon når du forbereder prøven. Hvis du tilvirker løsning fra pulver, bruk sterilt, destillert vann, og filtrér med et 0.45 eller 0.22 μm.
Med ditt mikroskop, kan det være at farvekonsentrasjonen skal være heller i den høyere enden av skalaen enn den lavere. Eksperimenter deg frem til hva som fungerer.
Husk at trypanblått er cytotoksisk (giftig for cellene), og at du må telle innen 5 - 10 minutter. Ellers vil cellene begynne å dø, og du får mye lavere viabilitet enn cellekulturen din har i virkeligheten.
Husk å rense hemocytometer og dekkplate med minimum 70% sprit og linsepapir etter bruk (dekkplater kan kasseres, men de kan fint gjenbrukes, så sparer man litt penger).
Dersom du fortsatt har problemer med å fokusere på rutenettet under telling, vil jeg anbefale å skaffe et hemocytometer med et "brightline grid." Her er tellekamrene dekket med en rhodiumfilm, som gjør at strekene fremstår som lyse. Det er ofte lettere å se mønsteret med et slikt.
Dette er en kort oppsummering og feilsøking. Hvis du fortsatt har problemer eller spørsmål, skal jeg gjerne utdype. Jeg regner med at du er fortrolig med de kalkulasjonene du trenger. Det er jo nokså enkel matematikk.
